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Zeocin是博来霉素/腐草霉素（bleomycin/phleomycin）抗生素家族的成员之一，从轮枝链霉菌Streptomyces verticillus中分离得到。作用谱广泛，对细菌、真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳动物细胞具很强的毒性。

Zeocin是腐草霉素D1的商业名称，一种碱性、水溶性、铜离子螯合的糖肽抗生素。铜离子的存在使得溶液为蓝色，此铜螯合的形式为无活性。当抗生素进入细胞后，二价铜离子（Cu²⁺）被还原为一价铜离子（Cu⁺），并被细胞内的巯基化合物去除。铜离子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其断裂，最终导致细胞死亡。来自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因赋予Zeocin抗性，该基因编码一种13,665Da大小的蛋白，以化学计量方式结合Zeocin，抑制其DNA双链切割活性。因此，能表达此蛋白的真核和原核宿主细胞被赋予Zeocin抗性。

• Zeocin对光敏感，需将抗生素，或含该抗生素的平板或培养基置于黑暗处。
  
• 降低细菌培养基的盐浓度，调整pH到7.5使其保持活性，因高离子强度和酸或碱性都会抑制Zeocin活性。
  
• 储存Zeocin在-30℃～-10℃，使用前需冰上融化。
  
• Zeocin有毒，操作时需注意防护，切勿与身体或皮肤直接接触。

• 大肠杆菌筛选：25～50μg/mL（低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L）
  
• 酵母菌筛选：50～300μg/mL（YPD或基本培养基）
  
• 哺乳动物细胞筛选：50～1000μg/mL（合适培养基，根据细胞系而不同）

• Zeocin的杀灭机制不同于新生霉素（neomycin）和潮霉素B（hygromycin B），细胞不会聚集成团和从培养板表面脱落。一旦接触到Zeocin，敏感细胞会出现如下的形态变化：
  ① 细胞体积明显增加（类似于巨细胞病毒感染容纳性细胞引起的肿大效应）；
  ② 异常的细胞形状包括细胞长臂（long appendages）出现；
  ③ 胞浆内出现大型空泡（源于内质网、高尔基体或支撑蛋白的破裂）；
  ④ 质膜和核膜破裂，导致膜上出现许多孔。这些敏感细胞最终会完全破损，仅仅以细胞碎片的形式存在。
  
• Zeocin抗性细胞按正常周期分化产生不同于敏感细胞的克隆。抗性细胞在形态上，与未接触Zeocin的正常细胞没有任何差异。
  
• Zeocin用于哺乳动物细胞筛选常用浓度为50～1000μg/mL（平均常用浓度为250～400μg/mL），影响筛选浓度的主要因素包括离子强度，细胞类型，细胞密度以及生长速率。以下步骤仅作参考，请根据自身实验体系做适当调整。

• 细胞对Zeocin敏感性的确定（杀灭曲线建立）
  
  • 重新铺板或者将满盘细胞重新分盘，使得细胞密度约25%，按照8个平板/组准备，培养24h，去除旧培养基。
    
  • 加入含不同浓度Zeocin的筛选培养基，Zeocin浓度可设置为0,50,100,200,400,600,800和1000μg/mL，每个浓度做3个平行；也可根据自身实验体系，设置不同的浓度梯度。
    
  • 每3～4天更换新鲜的筛选培养基，并观察存活细胞的比例。选择在合适时间（1～2周内）杀死大多数细胞的浓度为最佳工作浓度。
    注：若是难以在显微观察下区分活细胞，建议使用台盼蓝染色来计算存活细胞的数量，以确定Zeocin的最适浓度。
  
  
• 筛选稳定转染细胞系
  
  • 转染细胞，用100mm培养皿进行培养。以未转染的细胞作为阴性对照。
    
  • 转染后，用预热的1X PBS洗涤一次，加入新鲜培养基。
    
  • 转染48-72h后，用含有最佳浓度Zeocin（由灭杀曲线确定）的新鲜培养基筛选细胞。为了更好的鉴定和筛选细胞集落，建议将细胞按比例稀释成一系列浓度。
    注：若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞，按照以下方法克服此类耐性：用含Zeocin培养基进行细胞分盘，置于37℃孵育2-3h，使得细胞贴壁。然后将细胞置于4℃，2h。记得使用Hepes作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37℃孵育。4℃孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化，使得Zeocin能发挥作用，杀死细胞。
    
  • 每3～4天更换新鲜的选择培养基，直到出现细胞集落。
    
  • 挑选并转移克隆到96或48孔板中。在进行更大孔径培养板或培养皿上扩大培养之前，确保培养细胞密度近100%。
  
  
• 稳定转染细胞系的维持培养
  可采取以下方式维持培养稳定转染细胞：
  
  • 使用含相同剂量Zeocin的筛选培养基来维持培养；
    
  • 降低Zeocin剂量为原来的一半进行维持培养；
    
  • 使用正好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Zeocin剂量来维持培养【根据杀灭曲线来判断】；